Bakteriler çoğunlukla renksiz veya düşük kontrastlı oldukları için standart ışık mikroskobunda ayrıntılı olarak incelenmeleri zor olabilir. Bu nedenle mikrobiyolojide hücrelerin daha belirgin hâle gelmesini sağlayan çeşitli boyama teknikleri kullanılır.
Bu yöntemlerden biri olan Gram boyama, bakterilerin hücre zarfı özelliklerindeki farklılıklardan yararlanarak onları Gram-pozitif ve Gram-negatif olmak üzere iki temel gruba ayırmaya yardımcı olur.
Bakteriler prokaryotik hücrelerdir; yani zarla çevrili gerçek bir çekirdekleri bulunmaz. Sitoplazma, ribozomlar, hücre zarı ve genetik materyal temel yapıları arasındadır. Birçok bakteride peptidoglikandan oluşan hücre duvarı da bulunur. Kapsül, kamçı veya pilus gibi yapılar ise bütün bakterilerde bulunmaz.
Gram boyama, Danimarkalı hekim Hans Christian Gram tarafından 1884 yılında geliştirildi. Yöntem başlangıçta akciğer dokularındaki bakterilerin daha iyi görüntülenmesi amacıyla kullanılmış, daha sonra bakteriyolojinin temel ayırıcı boyama yöntemlerinden biri hâline gelmiştir.
Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriler arasındaki temel farklardan biri hücre zarfının yapısıdır.
Gram-pozitif bakterilerin hücre duvarında kalın bir peptidoglikan tabakası bulunur ve dış zarları yoktur. Gram-negatif bakterilerde ise peptidoglikan tabakası daha incedir ve bunun dışında lipopolisakkarit içeren ek bir dış zar bulunur.
Gram boyama sırasında bütün bakteriler başlangıçta kristal viyole boyasını alır. İyot eklendiğinde kristal viyole-iyot kompleksi oluşur. Daha sonra uygulanan alkol veya aseton bazlı renk giderici, Gram-pozitif ve Gram-negatif hücrelerde farklı sonuçlara yol açar.
Gram-pozitif bakteriler kristal viyole-iyot kompleksini büyük ölçüde koruduğu için mikroskop altında mor görünür.
Gram-negatif bakteriler ise renk giderme aşamasında ilk boyayı kaybeder. Ardından uygulanan safranin veya benzeri karşıt boya nedeniyle pembe-kırmızı görünür.
Bu fark yalnızca peptidoglikanın kalınlığına değil, hücre zarfının bütün yapısına ve boyaların hücre duvarından geçiş özelliklerine bağlıdır.
Gram-pozitif bakterilere Staphylococcus ve Streptococcus cinsleri; Gram-negatif bakterilere ise Escherichia coli ve Salmonella türleri örnek verilebilir.
Gram-negatif bakterilerin hücre zarfında, ince peptidoglikan tabakasının dışında ek bir dış zar bulunur.
Bu dış zarın dış yüzeyinin önemli bileşenlerinden biri lipopolisakkarittir (LPS). LPS'nin lipid A adı verilen bölümü, bağışıklık sistemi tarafından güçlü biçimde tanınabilir ve yoğun inflamatuvar yanıta yol açabilir.
Dış zar aynı zamanda bazı kimyasal maddelerin ve antibiyotiklerin hücre içine girişini sınırlandırabilen fiziksel bir bariyer görevi görür.
Ancak bu özellik, bütün Gram-negatif bakterilerin daha hastalık yapıcı olduğu veya bütün Gram-pozitif bakterilerin belirli antibiyotiklere duyarlı olduğu anlamına gelmez.
Bir bakterinin virülansı ve antibiyotik duyarlılığı; türüne, taşıdığı genlere, direnç mekanizmalarına ve çevresel koşullara bağlı olarak değişir.
Gram boyama, mikrobiyoloji laboratuvarlarında en yaygın kullanılan ayırıcı boyama yöntemlerinden biridir.
Yöntem bakteriler hakkında kısa sürede birkaç temel bilgi sağlayabilir:
Gram-pozitif veya Gram-negatif özellik gösterip göstermediği, hücrenin şekli, bakterilerin birbirlerine göre dizilişi, örnekte tek veya birden fazla morfolojik bakteri grubunun bulunup bulunmadığı.
Örneğin küresel bakteriler kok, çubuk biçimindekiler basil olarak tanımlanabilir. Hücrelerin kümeler, zincirler veya çiftler hâlindeki dizilişi de ön değerlendirmede ek bilgi sağlayabilir.
Gram boyama tek başına çoğu zaman bakterinin türünü kesin olarak belirleyemez. Kesin tanımlama için kültür, biyokimyasal testler, kütle spektrometrisi veya moleküler yöntemler gibi ek laboratuvar analizleri gerekebilir.
Gram boyamanın temel aşamaları dört ana basamakta özetlenebilir. Öncelikle bakteri örneği bir lam üzerine hazırlanır ve sabitlenir. İlk boya olarak kristal viyole uygulanır. Bu aşamada hücreler mor görünür. Ardından iyot çözeltisi uygulanır. İyot, kristal viyole ile kompleks oluşturarak boyanın hücre yapılarında tutulmasına katkı sağlar. Daha sonra alkol, aseton veya bunların karışımından oluşan renk giderici uygulanır. Bu aşama Gram boyamanın ayırıcı basamağıdır. Son olarak safranin gibi bir karşıt boya uygulanır. İşlem sonucunda Gram-pozitif bakteriler mor, Gram-negatif bakteriler ise pembe veya kırmızı tonlarında görülür. Boyanmış preparatlar genellikle ışık mikroskobunda yağ immersiyon objektifi kullanılarak incelenir.
Gram-pozitif bakterilerin hücre duvarında Gram-negatif bakterilere göre daha kalın bir peptidoglikan tabakası bulunur.
Renk giderme aşamasında alkol veya aseton Gram-pozitif hücre duvarındaki yapıları etkiler ve kristal viyole-iyot kompleksinin hücreden uzaklaşmasını sınırlar. Bu nedenle hücre mor rengini korur.
Gram-negatif bakterilerin hücre zarfında ise ince peptidoglikan tabakasının dışında lipid bakımından zengin bir dış zar bulunur. Renk giderici bu dış zarın yapısını bozarak kristal viyole-iyot kompleksinin uzaklaşmasını kolaylaştırır.
Böylece hücre ilk rengini kaybeder ve daha sonra uygulanan karşıt boyanın pembe-kırmızı rengini alır.
Gram boyama, enfeksiyon şüphesi bulunan örneklerin hızlı biçimde ön değerlendirmesinde kullanılabilir.
Örneğin balgam, beyin-omurilik sıvısı, yara örnekleri ve bazı diğer klinik materyaller mikroskop altında değerlendirilebilir.
Mikroskobik görüntü; bakteri varlığı, hücre şekli ve Gram özelliği hakkında kısa sürede bilgi sağlayabilir. Bu bilgiler klinik değerlendirme ve diğer laboratuvar sonuçlarıyla birlikte kullanıldığında enfeksiyon etkeninin belirlenmesine yönelik ilk değerlendirmeye katkıda bulunabilir.
Ancak Gram boyama tek başına antibiyotik duyarlılığını göstermez.
Antibiyotik tedavisinin seçilmesinde bakterinin türü, enfeksiyonun yeri, hastanın klinik durumu ve gerektiğinde kültür ile antimikrobiyal duyarlılık testlerinin sonuçları değerlendirilir.
Bütün bakteriler Gram boyamayla güvenilir biçimde Gram-pozitif veya Gram-negatif olarak sınıflandırılamaz.
Örneğin Mycobacterium türleri hücre duvarlarındaki yüksek miktardaki mikolik asit nedeniyle standart Gram boyamayla iyi değerlendirilmez ve asit-fast gibi farklı boyama yöntemleri kullanılır.
Bazı bakteriler çok ince oldukları veya hücre duvarı özellikleri farklı olduğu için Gram boyamada yeterince görünür olmayabilir.
Ayrıca preparatın hazırlanma biçimi, kültürün yaşı ve renk giderme süresindeki farklılıklar sonucu etkileyebilir.
Bu nedenle Gram boyama, mikrobiyolojide hızlı ve yararlı bir ilk inceleme yöntemi olmakla birlikte çoğu durumda diğer laboratuvar yöntemleriyle birlikte değerlendirilir.
